西亚试剂优势供应上万种化学试剂产品，欢迎各位新老客户咨询、选购！
中国
联系我们
联系方式：400-990-3999 / 邮箱：sales@xiyashiji.com
西亚试剂 —— 品质可靠，值得信赖
|
1．切除多余石蜡，暴露组织 |
|
2．将组织切碎（最大径<0.5mm），称重； |
|
3．溶于TE9提取液（组织<50mg/5ml,50～500mg/10ml）,高速混悬2～3min；于48℃放置24h，其制备见表18-6； |
|
4．再次混悬组织，加入蛋白酶K至终浓度1mg/ml,SDS至2%，孵育40h； |
|
5．用等体积酚-氯仿溶液抽提3次； |
|
6．2.5倍体积乙醇沉淀DNA |
|
7．-70℃放置2～4h |
|
8．9000×g离心1h |
|
9．沉淀物用70%乙醇洗1次 |
|
10．干燥，TE（pH7.2）溶解。 |
表18-6 TE9 DNA提取液的制备
|
500mmol/L |
Tris |
|
20mmol/L |
EDTA |
|
10mmoo/L |
NaCl |
|
1% |
SDS |
|
500μg/ml |
蛋白酶K |
|
|
PH8.0 |
5μm组织切片
↓
常规脱蜡、水化
↓
第一次溶液A孵育（去上清）
↓
第二次溶液A孵育（留上清）
↓
氯仿-异戊醇抽提
↓
RNA酶和蛋白酶消化
↓
酚抽提
↓
沉淀
↓
（却除未螺旋化DNA）↓
透析
图18-6 石蜡包埋组织DNA提取流程（Drbeau等，1986）
溶液A
|
2×SSC |
|
100μg 蛋白酶K/ml |
|
1% SDS |
不同类型的基因分析所要求的DNA质量长数量不同。Southern印迹杂交分析需要10～15μg大片段DNA（＞20kb），因为杂交前要进行相应的限制性内切酶消化和凝胶分离不同片段长度的DNA。故DNA提取要求高，小片段DNA存在会直接影响杂交信号。与之相反，多聚酶链反应（PCR）则可在相对粗制的小片段DNA样本上进行，分析所需的DNA很少，0.5μg甚至更少即可。PCR的模板DNA制备方法很多，除上述两种方法外，还有更简便的直接水煮法（Sle－bos,et al, 1990；Smit, et al. 1988）、蛋白酶消化法（Impraim et al. 1987；Brice, et al. 1989）。这些方法不经过酚-氯仿-异戊醇抽提、DNA纯化等步骤，直接将组织放在去离子水中煮沸10min或在蛋白酶K缓冲液中消化4h，DNA即可释放出来。此提取物可直接用作模板，进行PCR扩增，但是，我们发现直接水煮法和蛋白酶消化法提取的DNA，扩增率较低，且重复性不好。这可能是由于DNA附着的蛋白质去除不净而影响DNA变性和引物的结合，亦可能是由于标本中残留的固定剂等成分对Taq DNA多聚酶的抑制所致
