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傅立叶变换回旋共振质谱(Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry, FT-ICR MS)
FT-ICR MS是目前为止准确度最高的质谱, 可
得到1~2 ppm或更好的分辨率, 这样的高分辨率使其适合于磷酸化位点的分析。离子捕获解离(electroncapture dissociation, ECD)是应用于FT-ICR MS的一种技术, 是传统的串联质谱的补充。可以轻松打开二硫键, 而易断的翻译后修饰的共价键却可以在ECD破碎肽链时保存下来, 使得这一方法适合用于翻译后修饰的研究。
图1 利用MALDI-TOF/TOF谱图鉴定磷酸化肽段
a: 酶切产物的一级质谱图。磷酸化肽段的质谱峰用星号标出, 其相对未磷酸化肽段的理论分子量位移80 Da (HPO3 = 80 Da); b: a中标记星号的质谱峰的二级质谱分析。在图中可见比母离子小98 Da (H3PO4 = 98 Da)的中性缺失峰。
Fig.1 Phosphopeptide identification by MALDI-TOF/ TOF mapping
a: The Mass spectrum of a proteolytic digest. Phosphopeptide peak is marked with asterisk and shifted by 80 Da (HPO3 = 80 Da) relative to predicted unphosphorylated peptide mass; b: The MS/MS analysis of the peak marked with asterisk in a. The peak with neutral loss of 98 Da from the precursor ion (marked with asterisk) is found in this map.
3.2 轨道离子阱质谱技术(Orbitrap mass spectrometry)
该技术被认为是离子阱技术发明20年来, 这一领域所取得的最重大的技术革新。它采用了3级4极杆连接一个轨道离子阱, 其中第3个4极杆作为一个离子碰撞和加速器, 离子通过离子／中性碰撞减速并聚集进入4极杆末端的阱, 离子束由此最终进入质量分析器。Orbitrap具有非常高的灵敏度(亚飞克级水平), 高质量分辨率, 高准确度(2~5 ppm), 采集速度快, 质荷比范围可达到至少6 000, 动态范围超过10倍[17]。由于上述优点, 再加上Orbitrap可进行多级串联质谱分析, 使得其非常适合磷酸化位点的鉴定和比较研究。
3.3 大气压基质辅助激光解析(atmospheric press ure matrix-assisted laser desorption/ioniza tion, AP/MALDI)
这种离子化技术是2000年出现的一种技术, 是利用大气压环境替代了真空环境进行样品的电离, 随后电离的样本进入真空环境进行质谱分析。由于是在大气压下进行电离, 使得该技术可对液态和潮湿样本进行操作, 适用于更加多样的样本。因为离子内能可在大气压下迅速终止, 使得离子化过程更加温和, 有利于保留一些不稳定的修饰, 并有利于进行非共价复合体的研究。AP/MALDI可与多种质谱系统联用(如离子阱质谱)进行多级串联质谱研究, 从而适合磷酸化位点的分析[18]。
4 磷酸化蛋白、多肽的定量与比较
磷酸化蛋白或肽段的变化对于蛋白质行使功能起到重要作用, 磷酸化蛋白或肽段的定量分析是研究这些变化的必要手段。
Hegeman等[19]将研究的蛋白样本酶切后等分成两部分, 一部分直接用CH3OH甲酯化, 另一部分经过磷酸酯酶处理后用CD3OH甲酯化, 随后将两者混合进行串联质谱研究, 即可得到磷酸化肽段的磷酸化水平的定量信息。该技术设计巧妙, 但甲酯化的效率可能会影响定量结果。
近年来出现了一种基于稳定同位素标记的分析技术SILAC(stable isotope labeling with amino acids in cell culture)。该技术采用含有轻同位素型和重同位素型氨基酸的培养液对不同细胞分别进行培养, 使细胞内的蛋白被同位素稳定标记, 提取细胞蛋白并将其等量混合, 酶切后进行质谱鉴定, 通过分析不同标记型肽段的相对量而确定蛋白的相对量。这种方法既可以研究全蛋白质组的变化, 也可以结合磷酸化肽段的富集技术和串联质谱技术对磷酸化肽段进行定量研究。此外, 可用于肽段定量研究的iTRAQ、iCAT等技术同样可用于磷酸化肽段的研究。
除蛋白质组学技术外, 其它通量化的技术也可帮助我们进行磷酸化蛋白或多肽的研究。Gembitsky等 [20]将感兴趣的蛋白的抗体列阵于芯片上, 再将芯片浸泡于细胞或组织液中反应, 随后利用酪氨酸蛋白抗体与该芯片反应, 从而得到这些蛋白的酪氨酸磷酸化水平数据。该技术拥有芯片的所有优点, 但如能进一步改进, 结合质谱技术对磷酸化位点进行分析则会有更好的前景。
5 前景与展望
蛋白质组学研究已经进入到定量分析及功能蛋白质组研究阶段, 磷酸化修饰成为众多学者关注的重点。近年来相关的新技术层出不穷, 为我们提供了更多的选择。但现有的磷酸化修饰研究技术只能发现或分析那些结构性磷酸化位点, 而蛋白质功能的变化往往要借助于瞬时的磷酸化变化。因此, 我们期待着瞬时磷酸化修饰研究技术的涌现和突破。相信随着越来越多的新技术的出现, 将使我们对磷酸化修饰的研究更加深入, 并使我们更好的掌握蛋白质功能变化的规律。
