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摘要 磷酸化修饰是一种重要的蛋白质化学修饰, 对蛋白质功能的完成或改变起到重要作用。该领域的研究存在很多技术难点, 对该领域研究形成了挑战。近年来相关技术有了很多突破, 磷酸化研究也取得了很多新的成就。文章将从磷酸化蛋白的检出、磷酸化蛋白质和肽段的富集、生物质谱技术的改进以及磷酸化蛋白和多肽的定量与比较几个方面介绍该研究领域的技术进展。
关键词 磷酸化蛋白 磷酸化肽 生物质谱 定量分析
生命活动与蛋白质的动态变化密切相关, 很多情况下某些蛋白质的绝对量并不会发生明显变化, 而是通过各种翻译后修饰来完成或改变其功能。在数量众多的蛋白质翻译后修饰中, 磷酸化修饰是非常重要的一种, 现今发现的所有蛋白质中超过30%可被磷酸化修饰。蛋白质的磷酸化修饰与多种生物学过程密切相关, 如DNA损伤修复[1]、转录调节[2]、信号转导[3]、细胞凋亡的调节[4]等。磷酸化蛋白质及多肽的研究可帮助我们阐明上述过程的机理, 进一步认识生命活动的本质。近年来不断出现的许多相关的新技术、新方法推动了该领域研究的进展。
1 磷酸化蛋白的检出
当前针对蛋白的研究绝大多数是基于电泳的, 胶上磷酸化蛋白点的检出是一个重要环节。较早期的研究中最常用的方法是用32P标记的磷酸根通过代谢进入细胞中并被利用, 使得细胞内的磷酸化蛋白带有放射性的32P, 从而可在电泳后被检出[5]。该方法需要接触大量的放射性物质, 并且只能应用于培养的细胞, 所以已经逐渐被淘汰。利用抗磷酸化蛋白的抗体进行Western blot检测, 具有特异性好、分辨率高的优点, 至今还是常用的手段[6], 但由于分析和制备不能用同一块胶, 有时检出的蛋白点与胶上的蛋白点很难对应, 使分析变得困难。Schulenberg 等[7]在2003年报道了一种小分子的荧光染料Pro-Q Diamond dye, 可对磷酸化蛋白质特异性染色, 该方法方便、快捷且具有较高的灵敏性, 兼容质谱鉴定, 随后还可再进行其它方法的染色。Martin 等[8]将一些蛋白质和肽段列阵在几种商业化的衬底上, 然后利用Pro-Q Diamond dye检验芯片上的蛋白质及多肽的磷酸化水平, 灵敏度可达到312-625fg, 这种芯片与高灵敏度检出方法的结合提供了一个强有力的研究信号通路及磷酸酶抑制物的平台。荧光双向差异凝胶电泳(Fluorescent two dimensional difference gel electrophoresis, 2D-DIGE)是近几年出现的一种基于双向电泳的荧光标记蛋白质差异比较的技术, 具有非常好的检出灵敏度, 并且由于所要比较的目的蛋白始终在相同的条件进行一向、二向电泳并展示在同一张胶上, 从而减少了实验误差引起的差异, 该技术已经成为比较蛋白质组研究的有力工具。磷酸化蛋白质只是某个蛋白质组中的一小部分, DIGE技术不能对其特异性标记, 所以利用DIGE技术对磷酸化蛋白的比较分析是困难的。Seisuke 等[9]很好的解决了这一问题, 他们在实验中利用磷酸化蛋白富集试剂盒富集磷酸化蛋白后, 利用DIGE技术进行差异分析, 扩展了DIGE技术的应用范围。
2 磷酸化蛋白质、肽段的富集
由于磷酸化肽段相对于非磷酸化肽段来说是非常少的, 在质谱鉴定时易被其它肽段掩盖, 所以常常需要对磷酸化蛋白质或肽段富集后再进行鉴定。用于富集磷酸化蛋白质、肽段的经典方法有金属离子亲和层析(IMAC)[10]、生物素―亲和素富集[11]、免疫沉淀[12]和磷酸化抗体亲和层析[13]等方法。上述方法大多是基于层析技术, 而层析柱填料的性质则是影响富集效果的关键因素。2004年, Pinkse等[14]利用TiO2填料自制层析柱, 将自磷酸化蛋白PKG酶切产物用此柱分离后进行在线ESI-MS/MS分析, 鉴定出PKG至少有8个磷酸化位点, 并发现Ser-26 和 Ser-44两个新的磷酸化位点。Pinkse等认为TiO2填料可与磷酸化肽段高效、特异的结合, 从而有效富集磷酸化肽段, 应用前景很好。利用反相柱脱盐、浓缩肽段之后进行质谱鉴定是比较常用的肽段鉴定方法, 但对于亲水肽段, 比如磷酸化后变为亲水的磷酸化肽段鉴定效果不好。Larsen等[15]比较反相树脂与石墨填料柱对磷酸化肽段的分离效果, 认为后者可有效的滞留磷酸化肽段, 更适合磷酸化肽段的富集、分离和鉴定。对于磷酸化肽段的富集, 一些学者并没有将目光仅仅局限在亲和填料的改进上, Steven等[16]发现在pH2.7左右大部分胰蛋白酶酶切肽段带有两个正电荷, 而肽段上有一个磷酸化修饰时则带有一个正电荷, 根据这一现象, 可利用强阳离子交换色谱将带有一个正电荷的磷酸化肽段富集。Steven等利用这一方法在Hela细胞核中鉴定出967个蛋白中的2 002个磷酸化位点, 得到了现今为止最大的磷酸化蛋白谱。
3 利用生物质谱确认磷酸化位点
利用一级质谱结合串联质谱可确定磷酸化位点。例如通过MALDI-TOF/TOF一级质谱可发现与肽段分子量理论值相差80 Da (HPO3=80 Da) 的质谱峰, 该峰的二级质谱图中如果母离子与旁边的最高强度的质谱峰相差98 Da (中性丢失H3PO4=98 Da), 则可确定该肽段为磷酸化肽段(图1), 进一步通过二级或多级质谱的谱图确认具体的磷酸化位点。此外, 利用β－消除反应使丝氨酸、苏氨酸磷酸化残基转化为氨乙基丙氨酸, 后者为赖氨酸的同形物, 此位点可被胰蛋白酶和Lys-C 肽链内切酶等酶特异性识别、酶切, 通过质谱即可很容易地判断磷酸化位点。所以磷酸化位点的确认有赖于简化的质谱谱图和串联质谱的应用以及质谱检测灵敏度的提高。近年来生物质谱技术的发展为蛋白质磷酸化位点的检测提供了更多可选择的仪器和方法。
