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Transformation Efficiency of RasQ61 Mutants Linked to Structural Features of the Switch Regions in the Presence of Raf
Greg Buhrman,1 Glenna Wink,1 and Carla Mattos1,
1 Department of Molecular and Structural Biochemistry, North Carolina State University, 128 Polk Hall–CB 7622, Raleigh, NC 27695, USA
Corresponding author
Carla Mattos
Summary
Transformation efficiencies of Ras mutants at residue 61 range over three orders of magnitude, but the in vitro GTPase activity decreases 10-fold for all mutants. We show that Raf impairs the GTPase activity of RasQ61L, suggesting that the Ras/Raf complex differentially modulates transformation. Our crystal structures show that, in transforming mutants, switch II takes part in a network of hydrophobic interactions burying the nucleotide and precatalytic water molecule. Our results suggest that Y32 and a water molecule bridging it to the γ-phosphate in the wild-type structure play a role in GTP hydrolysis in lieu of the Arg finger in the absence of GAP. The bridging water molecule is absent in the transforming mutants, contributing to the burying of the nucleotide. We propose a mechanism for intrinsic hydrolysis in Raf-bound Ras and elucidate structural features in the Q61 mutants that correlate with their potency to transform cells
附：
ras癌基因的命名来自大鼠肉瘤（rat Sarcoma）的字首，1964年从大鼠肉瘤的急性逆转录病毒（Harvey murine Sarcoma Virus和Kister murine Sarcoma Virus）中分离出来。1982年在T24人膀胱癌细胞株中检测出具转化能力的ras癌基因，为Harvey大鼠肉瘤病毒癌基因的同系物，称C-Ha-ras；其后从人肺部细胞中发现Kister大鼠肉瘤病毒癌基因的同系物，称C-Ki-ras；从人神经胚胎瘤细胞的发现的另一种 ras癌基因称N-ras，该种与病毒无关。这三种哺乳动物基因组中普遍存在的 ras癌基因家族成员（Ha-ras-1、Ki-ras-2、N-ras）编码的蛋白质大约有90%的氨基酸序列同源，分子量均为21,000道尔顿，故称为rasp21蛋白，其在功能上与G蛋白相似，具与鸟苷酸结合的能力。rasp21蛋白与GDP结合为其非活性状态，与GTP结合为其活性状态，自身具弱GTPase活性，位于细胞膜内侧参与跨膜信号传递作用。人类原发肿瘤点突变主要发生在密码子12、13、59、61位，这些位点的突变都能使 ras癌基因活化。导致细胞增殖信号的持续流动，使细胞具有恶性潜能。
在哺乳动物肿发生中 ras癌基因的作用已在各种致癌物诱导的动物肿瘤模型中得到证实，致癌物多是些诱变剂，能直接引起 ras癌基因的活化， ras癌基因在诱发肿瘤中的高突变率及致癌物活化作用的可重复性，有力地说明ras癌基因在赘生物发生中具起始作用。
表1 在致癌剂诱导的动物肿瘤中ras癌基因被激活情况
癌基因名称 第一个外显子中第12倍密码子 P21N端第12位氨基酸
人正常c-Ha-ras1 GGC Gly
人T24膀胱癌c-Ha-ras 1 GTC Val
人-Ha-ras GGT Gly
人-正常c-Ki-ras 2 GGT Gly
人SW480结肠癌c-Ki-ras 2 GTT Val
人Calus 1肺癌c-Ki-ras 2 TGT Cys
V-Ki-ras AGT Ser
第二个外显子中突变密码子 P21N端第61位氨基酸
人正常c-Ki-ras CTG Glu
人工s242肺癌衍生
细胞系c-Ki-ras 2 CAG Leu
在人类肿瘤中检测ras癌基因点突变可推断ras癌基因点突变在其发生发展中的作用
