西亚试剂 ：Cell：一步生成条件性基因敲除小鼠ESC

最近发展的基因组编辑工具，包括转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)和CRISPR/Cas9，使我们能够通过诱导双链断裂(DSBs)的非同源末端连接(NHEJ)修复，快速而有效的敲除靶向基因。然而，这种方法不能进行必需基因的功能研究，这类研究通常采用的策略是基于Cre-LoxP系统的条件性基因敲除(cKO)。

这就需要通过同源重组(HR)和诱导Cre重组酶表达，进行loxP位点的靶向整合(敲入)。Cre融合蛋白和人类雌激素受体ERT2的突变配体结合域，常用于4-羟基他莫昔芬(4OHT)对Cre重组酶活性的控制，4OHT可促进CreERT2从细胞质到细胞核的易位，在那里Cre可识别和重组嵌入基因组DNA的loxP位点。4OHT控制的基因敲除，不仅能让我们选择一个时间窗，在一个必需基因表现出其致命表型之前，研究它的功能，而且也能让我们评估一个基因缺失的直接影响。

产生诱导型CKO小鼠胚胎干细胞(mESCs)的传统方法是非常费时、费力的，需要产生和杂交携带靶向cKO(两端各放一个loxP序列)等位基因的小鼠。最近，在小鼠受精卵中Cas9刺激的、含loxP的单链寡脱氧核苷酸(ssODNs)的整合，可简化CKO mESC的生产，但仍然依靠使用活体动物。为了遵循减少使用实验动物的原则，简化并加快CKO MESC的生产过程，研究人员一直都在试图提高工程核酸酶介导的HR事件，这将允许直接向mESCs插入LoxP位点。

七月十四日，来自瑞士巴塞尔大学、Friedrich Miescher生物医学研究所的研究人员在Cell子刊《Cell Reports》发表一项研究成果，题为“Single-Step Generation of Conditional Knockout Mouse Embryonic Stem Cells”。这项研究介绍了一种新的报告系统，可让我们一步实现高效的CKO mESCs体外生成，也能进行双等位基因的内源基因标记。

在这项研究中，研究人员开发了体外产生无标记cKO mESCs和内源基因标记的试剂和流程。这种方法是基于重组报告质粒，它们赋予了EGFP荧光性或嘌呤霉素对工程核酸酶诱导的DSB修复的抗性。不同于先前公布的报告系统——依赖于容易出错的DSB NHEJ修复，这种新的报告系统，仅在HR修复后变得功能性，从而同时报告工程核酸酶的活性和HR通路的活性。以上资料由西亚试剂：http://www.xiyashiji.com/