西亚试剂：通过结合CRISPRs和RNA导向的内切核酸酶

论文的主要作者、Doudna 研究组成员Samuel Sternberg 说：“Cas9和RNA导向的相似复合物是如何在整个基因组中找出并识别匹配的DNA靶点，一直以来是CRISPR–Cas领域的一个大谜题，这是一个经典的大海捞针的问题。所有正在开发RNA可编程Cas9实现基因组操作的科学家们，都依赖于它能够在细胞内靶向独特的20个碱基对序列的能力。然而，如果Cas9只是在整个基因组的一些随机位点盲目地结合DNA直至撞到它的靶DNA，那这个过程将会非常费时，它有可能无法有效地实现细菌免疫，或成为一种基因组操作工具。我们的研究表明，Cas9是通过首先寻找PAM序列来确定它的搜索范围。这加速了定位靶DNA的速度，最大限度地缩小了解读非靶向DNA位点的时间。”

Doudna、Sternberg和同事们利用一种独特的DNA窗帘分析法和全内反射荧光显微术(Total internal reflection fluorescence microscopy TIRFM)，在Cas9结合与解读DNA之时对单个Cas9进行了实时成像。DNA窗帘技术提供了前所未有的、关于Cas9靶点搜寻过程机制的一些新认识。采用传统的大量生物化学检测验证了成像的结果。

Sternberg 说：“我们发现Cas9只在识别PAM后才利用RNA–DNA碱基配对来解读DNA寻找匹配的序列，这样避免了意外地靶向细菌自身基因组中的匹配位点。然而，即使Cas9以某种方式与自身基因组中的一段匹配序列错误地结合，没有PAM也无法触发催化核酸酶的活性。利用这种DNA解读机制，PAM提供了两个冗余的检查点，确保Cas9不会错误地破坏它自身的基因组DNA。”

以上资料由西亚试剂：http://www.xiyashiji.com/ 提供