西亚试剂：CRISPR engineering turns on genes

RNA可作为基因调控的模块化支架。a. Konermann等人对天然的CRISPR短链向导RNA(short guide RNA, sgRNA)分子进行了改良，使其变成蛋白质装配的模块化支架;改良后的CRISPR sgRNA可形成复合物，利用多个转录调控区域的作用，来特异性地调节基因表达水平。sgRNA上的适配体(aptamer)结构可以招募特殊的蛋白质：在本案例中，适配体招募的蛋白质是与不同转录因子的转录激活域相融合的RNA结合蛋白。由于CRISPR RNA的不同区域均可以与靶DNA序列进行碱基互补配对，因此sgRNA复合物具有良好的DNA靶向特异性。dCas9酶通常都与CRISPR RNA结合在一起，有助于打开DNA的结构;dCas9也能够融合到另一个调控区域中，进而增加生物学效应的多样性。b. CRISPR系统的改良工作体现了天然的长链非编码RNA(long non-coding RNA, lncRNA)的设计原则，lncRNA能够招募多种可修饰染色质(即细胞核内组蛋白与DNA形成的复合体)、调节基因表达的细胞因子。

为了说明该方法的潜在应用价值，Konermann等人创建了一个sgRNA数据库，汇总了一系列能够分别启动23000个人类基因的改良后的sgRNA。他们随后逐个探讨哪个基因在被sgRNA激活后，可以促使黑色素瘤癌细胞逃避PLX-4720(治疗黑色素瘤的主要药物)的杀伤作用。不同的基因被激活后，可以使黑色素瘤癌细胞产生不同程度的抗药性，而抗药性的高低则取决于细胞在接受药物治疗后sgRNA的相对频率。在高度富集的sgRNA中，有一些sgRNA可以启动已知耐药性通路中的基因，还有一些sgRNA可以启动在抗药性黑色素瘤患者体内表达水平增高的基因，这就可以证明，SAM法能够确定基因表达水平改变后会发生哪些生物相关性结局。

CRISPR改良工作的成功可用于直接揭示天然的基因调控机制。增强子(enhancer)是一种能够启动基因表达的DNA序列，它们通常都含有一些可识别不同转录因子的识别序列。此外，增强子和其它调控元件通常都会转录出长链非编码RNA(long non-coding RNA, lncRNA)，这种RNA可以作为模块支架，利用各种各样可修饰染色质(即细胞核内由组蛋白与DNA形成的复合物)的细胞因子，调控基因的表达(图1b)。lncRNA就像放大的分子“菜谱”，既能够指导一系列生化作用的组合，也能够指导这些生化作用应该去影响哪些基因组位置。

最近还有另外两项研究也证明，在将dCas9或CRISPR RNA改良成模块化支架后，就大大提高了CRISPR引导性基因调控技术的效率或灵活性。其中一项研究还进一步表明，多种改良后的CRISPR RNA能够同时启动和关闭同一细胞内的不同基因，从而操控某一条代谢通路。Konermann等人的研究发现以及这两项研究均表明，天然lncRNA的模拟技术是一种有效的、协调多个蛋白质的方式，可以使这些蛋白质共同对整个基因组内产生影响。我们用一个sgRNA分子，也许就能够让各种效应蛋白作用于相同的基因组位置上。由于这类研究工具在生物技术领域中具有广泛的实用性，因此我们也有必要进一步构建一些新的多功能人工蛋白或非编码RNA。

下一代CRISPR技术为我们提供了一个绝佳的机会来研究多个基因和DNA序列的功能。在过去十年里，RNA干扰技术已经被广泛用于研究基因功能缺失后所造成的影响，但是由于存在非特异性靶向作用，因此这种方法出现假阳性结果的概率非常高。与此同时，如果利用过表达技术来开展功能获得性研究的话，可能无法阐明正常的RNA调控过程，例如选择性剪接(alternative splicing)。我们虽然可以根据锌指蛋白和TALEN等DNA结合蛋白的结构来合成人工转录因子，作为改变基因表达水平的备选方法，但是我们却难以在全基因组范围内构建这些人工转录因子。因此，CRISPR技术拥有其他技术无法比拟的强大优势：即CRISPR数据库的全面覆盖性以及CRISPR方法的模块化特性。然而，CRISPR靶向技术也会产生脱靶效应(off-target effect)，因此，如果我们利用这种方法来确定基因表达水平的改变会造成哪些影响，那么还需要开展额外的验证性试验来进行证实。

Konermann等人对黑色素瘤细胞进行了实验，最终确定了13个特殊的基因：当每个基因的表达水平发生改变时，都可以使黑色素瘤细胞产生抗药性。然而，一般而言，只有当多个基因同时进行复杂调控时，才能够导致疾病或严重生物学效应的发生——有一个很好的例子可以说明这一点：研究人员发现，四个基因必须同时进行表达时，才能够促使诱导性多潜能干细胞(induced pluripotent stem cell，是成熟细胞所产生的一类干细胞)的生成。因此，我们需要详尽地了解基因调控网络，也需要利用基因分库和基因剂量来进行实验，以便确定是哪些基因共同决定了某些性状。CRISPR/Cas系统将会成为一个用于实现该目标的万能工具，这是因为该系统能够对各种不同的效应结构域进行多重靶向和多重调控。

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